• Forum - ADN, Amorces, Résultat, Bonne qualité

les problèmes du séquençage

s'il vous plait, je me demande si quelqu'un pourrait m'aider.j'ai fait le séquençage d'un clone contenant de l'ADN ayant la taille de 1100pb avec les amorces T7 et SP6 mais le résultat a montré une région de très bonne qualité sur les 250 premiers nucléotides alors que le reste est contaminé et on observe un bourrage de pics.  [...] Si la séquence est bonne au début puis que subitement en l'espace de quelques bases tout devient mauvais, il faut que tu sois sur que ton ADN à séquencer est homogène et que tu n'as pas un mélange de populations.  [...]

problème

jai fais plusieurs pcr à partir d'ADN obtenus de sang et les migrations me donnent toujours le meme résultat. pas de bande ou pas les bandes controles.  [...] les amorces ont été vérifiées, la qualité des ADN sont bonnes.  [...]

[Biologie Moléculaire] problèmes de PCR , à l' aide!!!

voila j'ai des ennuis avec mes extraits d' adn d' insecte. après PCR l'électrophorèse sur gel ne montre aucune bande.j'ai quantifié au spectrophotomètre et la quantité d' adn varie de 10 à 30 nanogrammes/µl, le rapport 260/280 est bonne pour la plupart, mais ne donnent pas de résultat après PCR.  [...] 10 à 30ng /µL ne se voit pas nécessairement sur gel. En tout cas si la PCR avait fonctionné vous devriez avoir beaucoup plus que ça. Etes vous sur de vos amorces de la composition du mix du programme de la qualité des ADN de départ.  [...]

Projet clonage et expression d'un gène

De plus je valide mon Master 1 sur ce projet, et j'ai deux semaines de laboratoire libre pour le réaliser. Connaissez-vous une autre protéine membranaire qu'il serait possible de cloner et d'exprimer avec des résultats corrects.  [...] Pour faciliter le clonage, il est possible d'ajouter à l'extrémité des amorces des sites de restriction (cohésifs, c'est mieux ). Une fois les amorces choisis et produites, la PCR peut se faire de deux manières. Soit sur colonie directement (prendre une colonie (ou moitié de)), puis amplifier directement l'ADN d'intéret (avec les bonnes température et temps d'élongation).  [...]

qPCR

Déjà, premier truc, on utilise pas 2 dans la methode du, tu dois utiliser 1+ l'efficacité de tes amorces (et déjà etre sur que tes amorces on une bonne efficacité qui est bien proche de 1 ), ducoup 1+ efficacité te donne quelque chose proche de 2, c'est pourquoi on parle de la methode des, mais il faut utiliser dans chaque calcul, l'efficacité que tu as calculé pour ton couple d'amorce,, si tu n'as pas calculé celles ci, il faut le faire car si l'efficacité est eloignée de 1 ce n'est pas bon et il te faut choisir d'autres amorces.  [...] nous avons vérifié la qualité des amorces par PCR classique puis sur gel d'agarose la taille correspond et pas d'autre bandes, aussi les melting curve ne montrent pas de présence de dimères, mes amorces étaient bonne.  [...]

[Biologie Moléculaire] Rt-pcr

Il s'agit d'ARN murins. ET oui, en effet, j'avais l'impression qu'ils été plus dégradés après traitement DNAse... je test donc la RNAse out avant de faire la DNAse demain matin. j'espère que le problème vient de là. je vous remercie pour vos conseils et vous tiens au courant des résultats.  [...] ça peut venir de tes amorces si tu n'as pas d'amplification avec d'autres échantillons de bonne qualité, elles ne sont peut-être pas spécifiques de ton 28S.  [...]

[Génétique] PCR ou RT-PCR

La RT-PCR se fait à partir d'une matrice ARN. C'est à dire que le résultat dépend de l'expression du gène étudié dans le tissu analysé. Elle suppose une phase de reverse transcription pour produire un ADNc à partir des ARN. Cette phase est aspécifique, vous transformez l'ensemble des ARN.  [...] La PCR amplifie une séquence d'ADN donnée grâce à deux amorces définies, autrement dit elle a une valeur d'identification =si les amorces s'hybrident et si l'amplicon qu'on obtient à la bonne taille, dans ce cas, c'est qu'on a ce qu'on veut dans le tube. Ca permet donc de savoir que dans l'échantillon il y avait notre cellule ou notre gène.  [...]

[Génétique] Extraction, purification et analyse d'ARN (Nanodrop et bioanalyser)

Héhé, bonne question. En principe tu as autant d'ARNm que de cDNA, plus tous les ARN non rétrotranscrits (donc ARNt et r). Perso, lorsque je fais une RT avec des pDN6 (des amorces de 6 nucléotides aléatoires, donc potentiellement non sélectifs du type d'ARN) la quantité d'acides nucléiques double apres la RT.  [...] Pour les PCR classiques on utilise toujours des amorces ADN. C'est plus facile a synthétiser et a manipuler. In vivo pour la réplication il y a synthese d'amorces ARN par la primase qui sont ensuite remplacées par de l'ADN mais en PCR il n'y a pas de raison.  [...]

[Biologie Moléculaire] PCR en temps réel

Je dois exploiter les résultats que j'ai obtenu lors de ma PCR en temps réel. Elle a été effectuée sur des plants de riz transgénique et on cherche à savoir la quantité de protéine présente dans ces plants de riz.  [...] Enfin, courbe étalon. Elle permet de corréler la valeur du Ct que détecte la machine avec la quantité réelle d'ADN présente dans le tube au début du run. En théorie et comme vous le savez, la quantité d'ADN dans une PCR double à chaque cycle. En théorie oui mais ce n'est pas toujours vrai, et cela dépend de nombreux paramètres (qualité des amorces, quantité initiale, mix, paramètres de cycle, etc.  [...]

[Biologie Moléculaire] Réplication

Si les ADN polymérases réalisent les liaisons phosphodiester, alors à quoi servent les ligases A ressouder les amorces remplacées par de l'ADN à l'ADN préexistant.  [...] de ce que j'en sais, l'ADN ligase sert surtout à fermer les césure finales. Une fois que toutes les amorces ARN ont été éliminé suite au passage de l'ADN polymérase, cette dernière se détache et l'ADN ligase se fixe pour finir les brins. (Donc surtout en fin de réplication je pense, après il y peut être cette relation avec les amorces, je regarde de ce côté là.).  [...]